Toµn bé qu¸ tr×nh tiÕn hµnh thÝ nghiÖm ®­îc tãm t¾t qua s¬ ®å sau:

1. Phương ph¸p thu vµ xö lý mÉu trong phßng thÝ nghiÖm

    Thu c¸ vÒ ®¶m b¶o cßn sèng kháe m¹nh, tiÕn hµnh xö lý mÉu theo c¸c b­íc:

    LÊy m¸u theo ph­¬ng ph¸p Ivanova (1983): dïng xilanh chäc tõ phÇn sau gèc ®u«i ng­îc lªn sèng l­ng ®Ó lÊy m¸u trong ®éng m¹ch. B¶o qu¶n mÉu huyÕt thanh trong tñ l¹nh (4- 7⁰C) kho¶ng 1 giê, dïng pipetmen hót lÊy phÇn dÞch phÝa trªn vµ ly t©m l¹nh ®Ó lÊy dÞch huyÕt thanh.

     Mæ vµ t¸ch lÊy c¸c m« gan, tim, c¬, m¾t, nghiÒn trong dung dÞch nghiÒn mÉu +10µl dung dÞch. C¸c thao t¸c trªn ®Òu ®¶m b¶o mÉu lu«n ®­îc lµm l¹nh d­íi 10⁰C, tr¸nh sù biÕn tÝnh cña protein-enzyme (ë ®©y sö dông ®¸ l¹nh).

     Ly t©m l¹nh mÉu ®· nghiÒn, ®iÒu kiÖn ly t©m cho mçi lo¹i m« tr×nh bµy ë b¶ng 1:

    Sau khi ly t©m, dung pipetmen hót lÊy phÇn dÞch phÝa trªn, b¶o qu¶n trong ng¨n ®¸ tñ l¹nh. TÊt c¶ c¸c mÉu ®Òu ®­îc ®¸nh dÊu riªng biÖt.

2. TiÕn hµnh

    Chóng t«i sö dông kü thuËt ®iÖn di trªn gel  agaroza 1% (1g agaroza +100ml dung dÞch ®Öm gel), sö dông hÖ thèng lµm l¹nh Multitempt

Dung dÞch ®Öm ®iÖn cùc TC (pH=7.1):

Trisma-base:  1,3008 g

Citric acide:   0,7392 g

N­íc cÊt:       320 ml

Dung dÞch ®Öm gel: Pha dung dÞch ®Öm ®iÖn cùc víi n­íc cÊt theo tØ lÖ 1: 5

3. §æ b¶n gel

    C©n 1g agaroza, cho vµo trong mét b×nh nãn cïng 100ml dung dÞch ®Öm gel, ®un s«i c¸ch thuû trªn bÕp khuÊy tõ trong m­êi phót, ®æ gel vµo khung gel cã kÝch th­íc 22 x 16cm. Trong qu¸ tr×nh ®æ gel kh«ng ®Ó xuÊt hiÖn bät kh«ng khÝ trªn bÒ mÆt b¶n gel, ®îi gel nguéi, ®«ng ®Æc vµ ®Æt vµo tñ l¹nh kho¶ng 10 phót, tiÕn hµnh n¹p mÉu lªn b¶n gel.

4. N¹p mÉu

    T¸ch khu«n gel, t¹o r·nh n¹p vµ tiÕn hµnh n¹p mÉu. Mçi b¶n gel cã mét giÕng n¹p dung dÞch Bromophenol 1% ®Ó ®¸nh d¸u qu¸ tr×nh ch¹y. Trong qu¸ tr×nh n¹p mÉu, c¶ b¶n gel vµ mÉu ®Òu ®­îc gi÷ ë nhiÖt ®é thÊp d­íi 10⁰C. L­îng mÉu n¹p vµo ë mçi lo¹i m« lµ kh¸c nhau theo b¶ng sau:

 5.Ch¹y ®iÖn di

     B¶n gel sau khi n¹p mÉu ®­îc ®Æt vµo trong tñ l¹nh 15 phót cho thÊm mÉu, ®Æt b¶n gel ®· thÊm mÉu vµo m¸ng ®iÖn di cã chøa dung dÞch ®Öm ®iÖn cùc (®· ®­îc lµm l¹nh tíi 4⁰C bµng hÖ thèng Multitempt). Dïng cÇu nèi tÈm ­ít dung dÞch ®Öm diÖn cùc vµ phñ lªn hai ®Çu b¶n gel kho¶ng 2cm. §Æt chÕ ®é ®iÖn di nh­ sau:

EST:  250V- 45mA- 12W- 4h30

LDH: 200V- 40mA - 8W – 5h30

6. Nhuém b¶n gel

    Sau khi ch¹y ®iÖn di xong, t¾t ®iÖn, lÊy b¶n gel ra khái m¸ng, dïng dung dÞch thuèc nhuém ®· pha t­íi ®Òu lªn bÒ mÆt b¶n gel, ®Æt vµo trong tñ Êm 37⁰C trong 20- 30 phót. Khi thÊy hiÖn râ c¸c d¶i band, dïng dung dÞch cè ®Þnh mÉu röa qua bÒ mÆt b¶n gel. §äc kÕt qu¶ vµ chôp ¶nh l­u gi÷.

    Mçi lo¹i enzym ®ùc nhuém bëi c¸c c¬ chÊt, chÊt xóc t¸c vµ thuèc nhuém ®Æc hiÖu cho tõng lo¹i.

7. C¸ch x¸c ®Þnh, ®Æt tªn cÊu tö

Dùa vµo gi¶ thuyÕt vÒ mét gen – 1 chuçi polypeptit, ta cã:

     * NÕu ph©n tö protein enzyme cã cÊu tróc monomer th× c¬ thÓ ®ång hîp tö cã mét cÊu tö ®iÖn di.

    *NÕu ph©n tö protein enzyme cã cÊu tróc dimer th× c¬ thÓ ®ång hîp tö cã mét cÊu tö ®iÖn di, c¬ thÓ dÞ hîp tö cã 3 cÊu tö diÖn di. CÊu tö diÖn di trung gian la ph©n tö lai.

    *NÕu ph©n tö protein enzym cã cÊu tróc tetramer th× c¬ thÓ ®ång hîp tö cã mét cÊu tö ®iÖn di, c¬ thÓ di hîp tö cã 5 cÊu tö ®iÖn di, cÊu tö trung gian lµ c¬ thÓ lai.

    * Ngoµi ra c¨n cø vµo tèc ®é chuyÓn ®éng t­¬ng ®èi cña c¸c cÊu tö, sè cÊu tö, c­êng ®é b¾t mÇu cña c¸c cÊu tö ta x¸c ®Þnh sè locus kiÓm so¸t tæng hîp enzyme, tõ ®ã ta cã c¸c kiÓu gen ®ång hîp tö vµ dÞ hîp tö kh¸c nhau (Ferguson, 1980).

    C¸ch ®Æt tªn quy ®Þnh nh­ sau: C¸c locus ®­îc ký hiÖu lÇn l­ît lµ sè 1,2,3….. sau tªn viÕt t¾t cña enzyme theo chiÒu chuyÓn ®éng cña c¸c cÊu tö. Trong mçi locus, allele nµo xuÊt hiÖn víi tÇn sè nhiÒu nhÊt sÏ ®­îc ký hiÖu lµm chuÈn lµ 100 ( theo chiÒu chuyÓn ®éng cña c¸c cÊu tö ), C¸c allele kh¸c ®­îc ký hiÖu dùa vµo phÇn tr¨m kho¶ng c¸ch cña allele ®ã víi allele chuÈn (Allendorf, Utter, 1979).

8. Ph©n tÝch kÕt qu¶ ®iÖn di

TÝnh tÇn sè alllele theo c«ng thøc (Ayala, 1982):

                                                2n₁  + n₂

                                     P = ------------------

                                                     N

Trong ®ã: n₁  lµ sè c¸ thÓ ®ång hîp

                 n₂  lµ sè c¸ thÓ dÞ hîp   

                 N lµ sè c¸ thÓ nghiªn cøu

TÝnh tÇn sè kiÓu gen xuÊt hiÖn trong mÉu nghiªn cøu. §­îc tÝnh theo c«ng thøc:

                                                n

                                     P = -------------

                                                N

Trong ®ã: P lµ tÇn sè kiÓu gen quan s¸t

     n lµ sè kiÓu gen quan s¸t thÊy

     N lµ sè c¸ tthÓ l©y mÉu

            * TÇn sè kiÓu gen lý thuyÕt: lµ sù ph©n phèi nh÷ng kiªu gen ®ã tÝnh cho c¶ quÇn ®µn .

¸p dông ®Þnh luËt Hardy – Weinberg

      p² AA + 2pqAa + q²aa = 1

Trong ®ã; p²AA lµ sè c¸ thÓ ®ång hîp tö AA

     2pqAa lµ sè c¸ thÓ dÞ hîp tö Aa

      q²aa lµ sè c¸ thÓ ®ång hîp tö aa

9. Xö lý sè liÖu

    Sö  dông ph­¬ng ph¸p kiÓm ®Þnh χ² bËc tù do n-1 víi gi¶ thuyÕt H₀ lµ tÇn sè kiÓu gen lý thuyÕt vµ tÇn sè kiÓu gen quan s¸t sai kh¸c nhau mét c¸ch ngÉu nhiªn, kh«ng cã ý nghÜa thèng kª. H₁ lµ tÇn sè kiÓu gen thùc nghiÖm vµ tÇn sè kiÓu gen lý thuyÕt sai kh¸c nhau do quy luËt.

                                                  ( E_i – O_i)²

                                     χ² = Σ ------------------

                                                        E_i

Trong ®ã: O_i: TÇn sè thùc nghiÖm

                 E_i: TÇn sè lý thuyÕt

            NÕu χ²_tn <  χ² trong b¶ng chuÈn th× gi¶ thuyÕt H₀ ®­îc chÊp nhËn vµ ng­îc l¹i th× chÊp nhËn gi¶ thuyÕt H₁.

Đây mới chỉ những kết quả bước đầu nghiên cứu, các nghiên cứu tiếp sau sẽ được thường xuyên cập nhật.